炭疽防治技术规范

2020-11-20 15:18 | 呼和浩特市动物疫病防控中心   
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炭疽(Anthrax)是由炭疽芽胞杆菌引起的一种人畜共患传染病。世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须报告的动物疫病,我国将其列为二类动物疫病。

为预防和控制炭疽,依据《中华人民共和国动物防疫法》和其它相关法律法规,制定本规范。

1  适用范围

本规范规定了炭疽的诊断、疫情报告、疫情处理、防治措施和控制标准。

本规范适用于中华人民共和国境内一切从事动物饲养、经营及其产品的生产、经营的单位和个人,以及从事动物防疫活动的单位和个人。

2  诊断

依据本病流行病学调查、临床症状,结合实验室诊断结果做出综合判定。

2.1  流行特点

本病为人畜共患传染病,各种家畜、野生动物及人对本病都有不同程度的易感性。草食动物最易感,其次是杂食动物,再次是肉食动物,家禽一般不感染。人也易感。

患病动物和因炭疽而死亡的动物尸体以及污染的土壤、草地、水、饲料都是本病的主要传染源,炭疽芽胞对环境具有很强的抵抗力,其污染的土壤、水源及场地可形成持久的疫源地。本病主要经消化道、呼吸道和皮肤感染。

本病呈地方性流行。有一定的季节性,多发生在吸血昆虫多、雨水多、洪水泛滥的季节。

2.2  临床症状

2.2.1  本规范规定本病的潜伏期为20天。

2.2.2  典型症状

本病主要呈急性经过,多以突然死亡、天然孔出血、尸僵不全为特征。

牛:体温升高常达41℃以上,可视黏膜呈暗紫色,心动过速、呼吸困难。呈慢性经过的病牛,在颈、胸前、肩胛、腹下或外阴部常见水肿;皮肤病灶温度增高,坚硬,有压痛,也可发生坏死,有时形成溃疡;颈部水肿常与咽炎和喉头水肿相伴发生,致使呼吸困难加重。急性病例一般经24~36小时后死亡,亚急性病例一般经2~5天后死亡。

马:体温升高,腹下、乳房、肩及咽喉部常见水肿。舌炭疽多见呼吸困难、发绀;肠炭疽腹痛明显。急性病例一般经24~36小时后死亡,有炭疽痈时,病程可达3~8天。

羊:多表现为最急性(猝死)病症,摇摆、磨牙、抽搐,挣扎、突然倒毙,有的可见从天然孔流出带气泡的黑红色血液。病程稍长者也只持续数小时后死亡。

猪:多为局限性变化,呈慢性经过,临床症状不明显,常在宰后见病变。

犬和其它肉食动物临床症状不明显。

2.3  病理变化

死亡患病动物可视黏膜发绀、出血。血液呈暗紫红色,凝固不良,粘稠似煤焦油状。皮下、肌间、咽喉等部位有浆液性渗出及出血。淋巴结肿大、充血,切面潮红。脾脏高度肿胀,达正常数倍,脾髓呈黑紫色。

严禁在非生物安全条件下进行疑似患病动物、患病动物的尸体剖检。

2.4  实验室诊断

实验室病原学诊断必须在相应级别的生物安全实验室进行。

2.4.1  病原鉴定

2.4.1.1  样品采集、包装与运输

按照NY/T561 2.1.2、4.1、5.1执行。

2.4.1.2  病原学诊断

炭疽的病原分离及鉴定(见NY/T561)。

2.4.2  血清学诊断   

炭疽沉淀反应(见NY/T561)。

2.4.3  分子生物学诊断

聚合酶链式反应(PCR)(见附件1)。

3  疫情报告

3.1  任何单位和个人发现患有本病或者疑似本病的动物,都应立即向当地动物防疫监督机构报告。

3.2  当地动物防疫监督机构接到疫情报告后,按国家动物疫情报告管理的有关规定执行。

4  疫情处理

依据本病流行病学调查、临床症状,结合实验室诊断做出的综合判定结果可做为疫情处理依据。

4.1  当地动物防疫监督机构接到疑似炭疽疫情报告后,应及时派员到现场进行流行病学调查和临床检查,采集病料送符合规定的实验室诊断,并立即隔离疑似患病动物及同群动物,限制移动。

对病死动物尸体,严禁进行开放式解剖检查,采样时必须按规定进行,防止病原污染环境,形成永久性疫源地。

4.2  确诊为炭疽后,必须按下列要求处理。

4.2.1 由所在地县级以上兽医主管部门划定疫点、疫区、受威胁区。

点:指患病动物所在地点。一般是指患病动物及同群动物所在畜场(户组)或其它有关屠宰、经营单位。

区:指由疫点边缘外延3公里范围内的区域。在实际划分疫区时,应考虑当地饲养环境和自然屏障(如河流、山脉等)以及气象因素,科学确定疫区范围。

受威胁区:指疫区外延5公里范围内的区域。

4.2.2 本病呈零星散发时,应对患病动物作无血扑杀处理,对同群动物立即进行强制免疫接种,并隔离观察20天。对病死动物及排泄物、可能被污染饲料、污水等按附件2的要求进行无害化处理;对可能被污染的物品、交通工具、用具、动物舍进行严格彻底消毒(见附件2)。疫区、受威胁区所有易感动物进行紧急免疫接种。对病死动物尸体严禁进行开放式解剖检查,采样必须按规定进行,防止病原污染环境,形成永久性疫源地。

4.2.3   本病呈暴发流行时(1个县10天内发现5头以上的患病动物),要报请同级人民政府对疫区实行封锁;人民政府在接到封锁报告后,应立即发布封锁令,并对疫区实施封锁。

疫点、疫区和受威胁区采取的处理措施如下:

4.2.3.1  疫点

出入口必须设立消毒设施。限制人、易感动物、车辆进出和动物产品及可能受污染的物品运出。对疫点内动物舍、场地以及所有运载工具、饮水用具等必须进行严格彻底地消毒。

患病动物和同群动物全部进行无血扑杀处理。其它易感动物紧急免疫接种。

对所有病死动物、被扑杀动物,以及排泄物和可能被污染的垫料、饲料等物品产品按附件2要求进行无害化处理。

动物尸体需要运送时,应使用防漏容器,须有明显标志,并在动物防疫监督机构的监督下实施。

4.2.3.2  疫区:交通要道建立动物防疫监督检查站,派专人监管动物及其产品的流动,对进出人员、车辆须进行消毒。停止疫区内动物及其产品的交易、移动。所有易感动物必须圈养,或在指定地点放养;对动物舍、道路等可能污染的场所进行消毒。

对疫区内的所有易感动物进行紧急免疫接种。

4.2.3.3  受威胁区:对受威胁区内的所有易感动物进行紧急免疫接种。

4.2.3.4  进行疫源分析与流行病学调查

4.2.3.5  封锁令的解除

最后1头患病动物死亡或患病动物和同群动物扑杀处理后20天内不再出现新的病例,进行终末消毒后,经动物防疫监督机构审验合格后,由当地兽医主管部门向原发布封锁令的机关申请发布解除封锁令。

4.2.4  处理记录

对处理疫情的全过程必须做好完整的详细记录,建立档案。

5  预防与控制

5.1  环境控制

饲养、生产、经营场所和屠宰场必须符合《动物防疫条件审核管理办法》(农业部[2002]15号令)规定的动物防疫条件,建立严格的卫生(消毒)管理制度。

5.2  免疫接种

5.2.1  各省根据当地疫情流行情况,按农业部制定的免疫方案,确定免疫接种对象、范围。

5.2.2  使用国家批准的炭疽疫苗,并按免疫程序进行适时免疫接种,建立免疫档案。

5.3  检疫

5.3.1  产地检疫

GB16549和《动物检疫管理办法》实施检疫。检出炭疽阳性动物时,按本规范4.2.2规定处理。

5.3.2  屠宰检疫

NY467和《动物检疫管理办法》对屠宰的动物实施检疫。

5.4  消毒 

对新老疫区进行经常性消毒,雨季要重点消毒。皮张、毛等按照附件2实施消毒。

5.5  人员防护 

动物防疫检疫、实验室诊断及饲养场、畜产品及皮张加工企业工作人员要注意个人防护,参与疫情处理的有关人员,应穿防护服、戴口罩和手套,做好自身防护。


附件1

 

聚合酶链式反应(PCR)技术

 

1  试剂

1.1  消化液

1.1.1  1M 三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)(pH8.0)

三羟甲基氨基甲烷                              12.11g

灭菌双蒸水                                      80mL

浓盐酸                                   pH8.0

灭菌双蒸水                                加至100mL

1.1.2  0.5M 乙二铵四乙酸二钠(EDTA)溶液 (pH8.0)

二水乙二铵四乙酸二钠                          18.61g

灭菌双蒸水                                      80mL

氢氧化钠                                 pH8.0

灭菌双蒸水                                 加至100mL

1.1.3  20% 十二烷基磺酸钠(SDS)溶液 (pH7.2)

十二烷基磺酸钠                                   20g

灭菌双蒸水                                      80mL

浓盐酸                                   pH7.2

灭菌双蒸水                                 加至100mL

1.1.4  消化液配制

1M 三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)(pH8.0)        2mL

0.5mol/L 乙二铵四乙酸二钠溶液(pH8.0)           0.4mL

20% 十二烷基磺酸钠溶液(pH7.2)                    5mL

5M 氯化钠                                        4mL

灭菌双蒸水                                加至200mL

1.2  蛋白酶K溶液

蛋白酶K                                         5g

灭菌双蒸水                                加至250mL

1.3  酚/氯仿/异戊醇混合液

碱性酚                                         25mL

氯仿                                           24mL

异戊醇                                          1mL

1.4  2.5mmol/LdNTP

dATP(100mmol/L)                                20µL

dTTP(100mmol/L)                                20µL

dGTP(100mmol/L)                                20µL

dCTP(100mmol/L)                                20µL

灭菌双蒸水                               加至800µL

1.5  8pmol/µL PCR引物

上游引物ATXU(2 OD)加入701µl灭菌双蒸水溶解下游引物ATXD(2 OD)加入697µL灭菌双蒸水溶解分别取ATXUATXD溶液各300µL,混匀即为8pmol/µL 扩增引物。

1.6  0.5单位Taq DNA聚合酶

5单位Taq DNA聚合酶                            1µL

灭菌双蒸水                                加至10µL

现用现配。

1.7  10×PCR缓冲液

1.7.1  1mol/L 三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)( pH9.0)

三羟基甲基氨基甲烷                            15.8g

灭菌双蒸水                                     80mL

浓盐酸                                  pH9.0

灭菌双蒸水                               加至100mL

1.7.2  10倍PCR缓冲液

1mol/L三羟基甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)( pH9.0) 1mL

氯化钾                                       0.373g

曲拉通X-100                                   0.1mL

灭菌双蒸水                                加至100mL

1.8  溴化乙锭(EB)溶液

溴化乙锭                                       0.2g

灭菌双蒸水                                 加至20mL

1.9  电泳缓冲液(50倍)

1.9.1  0.5mol/L 乙二铵四乙酸二钠(EDTA)溶液 (pH8.0)

二水乙二铵四乙酸二钠                         18.61g

灭菌双蒸水                                     80mL

氢氧化钠                                pH8.0

灭菌双蒸水                               加至100mL

1.9.2  TAE电泳缓冲液(50倍)

三羟基甲基氨基甲烷(Tris)                      242g

冰乙酸                                      57.1mlL

0.5mol/L乙二铵四乙酸二钠溶液(pH8.0)          100mL

灭菌双蒸水                             加至1 000mL

用时用灭菌双蒸水稀释使用

1.10  1.5%琼脂糖凝胶

琼脂糖                                          3g

TAE电泳缓冲液(50倍)                            4mL

灭菌双蒸水                                    196mL

微波炉中完全融化,加溴化乙锭(EB)溶液20µL。

1.11  上样缓冲液

溴酚蓝0.2g,加双蒸水10mL过夜溶解。50g蔗糖加入50ml水溶解后,移入已溶解的溴酚蓝溶液中,摇匀定容至100mL。

1.12  其它试剂

异丙醇(分析纯)

70%乙醇

15mmoL/L氯化镁

灭菌双蒸水

2  器材

2.1  仪器

分析天平、高速离心机、真空干燥器、PCR扩增仪、电泳仪、电泳槽、紫外凝胶成像仪(或紫外分析仪)、液氮或-70℃冰箱、微波炉、组织研磨器、-20℃冰箱、可调移液器(2µL 、20µL、200µL、1000µL)。

2.2  耗材

眼科剪、眼科镊、称量纸、20 mL一次性注射器、1.5 mL灭菌离心管、0.2 mL薄壁PCR管、琼脂糖、500 mL量筒、500 mL锥形瓶、吸头(10µL、200µL、1000µL)、灭菌双蒸水。

2.3  引物设计

根据GenBank上已发表的炭疽杆菌POX1质粒序列,设计并合成了以下两条引物:

ATXU5-AGAATGTATCACCAGAGGC-3 ATXD:5-GTTGTAGATTGGAGC

CGTC-3,此对引物扩增片段为394bp

2.4  样品的采集与处理

2.4.1  样品的采集

病死或扑杀的动物取肝脏或脾;待检的活动物,用注射器取血5~10mL,2~8℃保存,送实验室检测。

2.4.2   样品的处理

每份样品分别处理。

2.4.2.1  组织样品处理

称取待检病料0.2g,置研磨器中剪碎并研磨,加入2mL消化液继续研磨。取已研磨好的待检病料上清100µL加入1.5 mL灭菌离心管中,再加入500µL消化液和10µL蛋白酶K溶液,混匀后,置55℃水浴中4~16h。

2.4.2.2  待检菌的处理

取培养获得的菌落,重悬于生理盐水中。取其悬液100µL加入1.5mL灭菌离心管中,再加入500µL 消化液和10µL 蛋白酶K溶液,混匀后,置55℃水浴中过夜。

2.4.2.3  全血样品处理

待血凝后取上清放于离心管中,4℃ 8000 g离心5 分钟,取上清100µL,加入500µL消化液和10µL蛋白酶K溶液,混匀后,置55℃水浴中过夜。

2.4.2.4  阳性对照处理

取培养的炭疽杆菌,重悬于生理盐水中。取其悬液100µL,置1.5 mL灭菌离心管中,加入500µL消化液和10µL蛋白酶K溶液,混匀后,置55℃水浴中过夜。

2.4.2.5  阴性对照处理

取灭菌双蒸水100µL,置1.5 mL灭菌离心管中,加入500µL 消化液10µl蛋白酶K溶液,混匀后,置55℃水浴中过夜。

2.5  DNA模板的提取

2.5.1  取出已处理的样品及阴、阳对照,加入600µL酚/氯仿/异戊醇混合液,用力颠倒10次混匀,12000g离心10分钟。

2.5.2  取上清置1.5mL灭菌离心管中,加入等体积异丙醇,混匀,置液氮中3分钟。取出样品管,室温融化,15000rpm离心15分钟。

2.5.3  弃上清,沿管壁缓缓滴入1ml 70%乙醇,轻轻旋转洗一次后倒掉,将离心管倒扣于吸水纸上1分钟,真空抽干15分钟(以无乙醇味为准)。

2.5.4  取出样品管,用50µL灭菌双蒸水溶解沉淀,作为模板备用。

2.6  PCR扩增

总体积20µl,取灭菌双蒸水8µl,2.5mmol/L dNTP8pmol/µL扩增引物、15mmol/L氯化镁、10×PCR缓冲液、0.5单位TaqDNA聚合酶各2µL,2µL模板DNA。混匀,作好标记,加入矿物油20µL覆盖(有热盖的自动DNA热循环仪不用加矿物油)。扩增条件为94℃ 3分钟后,94℃ 30s,58℃ 30s,72℃ 30s循环35次,72℃延伸 5分钟。

2.7  电泳

PCR扩增产物15µL混合3µL上样缓冲液,点样于1.5%琼脂糖凝胶孔中,以5V/cm电压于1×TAE缓冲液中电泳,紫外凝胶成像仪下观察结果。

2.8  结果判定

在阳性对照出现394bp扩增带、阴性对照无带出现(引物带除外)时,试验结果成立。被检样品出现394bp扩增带为炭疽杆菌阳性,否则为阴性。


附件2

无害化处理

 

1  炭疽动物尸体处理

应结合远离人们生活、水源等因素考虑,因地制宜,就地焚烧。如需移动尸体,先用5%福尔马林消毒尸体表面,然后搬运,并将原放置尸地及尸体天然孔出血及渗出物用5%福尔马林浸渍消毒数次,在搬运过程中避免污染沿途路段。焚烧时将尸体垫起,用油或木柴焚烧,要求燃烧彻底。无条件进行焚烧处理时,也可按规定进行深埋处理。

2  粪肥、垫料、饲料的处理

被污染的粪肥、垫料、饲料等,应混以适量干碎草,在远离建筑物和易燃品处堆积彻底焚烧,然后取样检验,确认无害后,方可用作肥料。

3   房屋、厩舍处理

开放式房屋、厩舍可用5%福尔马林喷洒消毒三遍,每次浸渍2小时。也可用20%漂白粉液喷雾,200mL/m2作用2小时。对砖墙、土墙、地面污染严重处,在离开易燃品条件下,亦可先用酒精或汽油喷灯地毯式喷烧一遍,然后再用5%福尔马林喷洒消毒三遍。

对可密闭房屋及室内橱柜、用具消毒,可用福尔马林熏蒸。在室温18℃条件下,对每25~30m3空间,用10%浓甲醛液(内含37%甲醛气体)约4000mL,用电煮锅蒸4小时。蒸前先将门窗关闭,通风孔隙用高粘胶纸封严,工作人员戴专用防毒面具操作。密封8~12小时后,打开门窗换气,然后使用。

熏蒸消毒效果测定,可用浸有炭疽弱毒菌芽孢的纸片,放在含组氨酸的琼脂平皿上,待熏后取出置37℃培养24小时,如无细菌生长即认为消毒有效。

也可选择其它消毒液进行喷洒消毒,如4%戊二醛(pH8.0~8.5)2小时浸洗、5%甲醛(约15%福尔马林)2小时、3% H2O22小时或过氧乙酸2小时。其中,H2O2和过氧乙酸不宜用于有血液存在的环境消毒;过氧乙酸不宜用于金属器械消毒。

4  泥浆、粪汤处理

猪、牛等动物死亡污染的泥浆、粪汤,可用20%漂白粉液1份(处理物2份),作用2小时;或甲醛溶液50~100ml/m3比例加入,每天搅拌1~2次,消毒4天,即可撒到野外或田里,或掩埋处理(即作深埋处理)。

5  污水处理

按水容量加入甲醛溶液,使其含甲醛液量达到5%,处理10小时;或用3%过氧乙酸处理4小时;或用氯胺或液态氯加入污水,于pH4.0时加入有效氯量为4mg/L,30分钟可杀灭芽孢,一般加氯后作用2小时流放一次。

6  土壤处理

炭疽动物倒毙处的土壤消毒,可用5%甲醛溶液500mL/m2消毒三次,每次2小时,间隔1小时。亦可用氯胺或10%漂白粉乳剂浸渍2小时,处理2次,间隔1小时。亦可先用酒精或柴油喷灯喷烧污染土地表面,然后再用5%甲醛溶液或漂白粉乳剂浸渍消毒。

7  衣物、工具及其它器具处理

耐高温的衣物、工具、器具等可用高压蒸汽灭菌器在121℃高压蒸汽灭菌1小时;不耐高温的器具可用甲醛熏蒸,或用5%甲醛溶液浸渍消毒。运输工具、家具可用10%漂白粉液或1%过氧乙酸喷雾或擦拭,作用1~2小时。凡无使用价值的严重污染物品可用火彻底焚毁消毒。

8  皮、毛处理

皮毛、猪鬃、马尾的消毒,采用97~98%的环氧乙烷、2%的CO21%的十二氟混合液体,加热后输入消毒容器内,经48小时渗透消毒,启开容器换气,检测消毒效果。但须注意,环氧乙烷的熔点很低(<0℃),在空气中浓度超过3%,遇明火即易燃烧发生爆炸,必须低温保存运输,使用时应注意安全。

骨、角、蹄在制作肥料或其它原料前,均应彻底消毒。如采用121℃高压蒸汽灭菌;或5%甲醛溶液浸泡;或用火焚烧。



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炭疽防治技术规范